Но главным делом жизни великой княгини стала созданная на её личные средства Марфо-Мариинская обитель любви, труда и милосердия на Большой Ордынке.
При открытии обители в феврале 1909 года было всего шесть сестёр, но в течение года число их выросло до 30. В апреле 1910 года епископом Трифоном (Туркестановым) в домовой церкви обители были посвящены по утверждённому Святейшим Синодом чину 17 сестёр, в том числе великая княгиня, возведённая на следующий день митрополитом Московским Владимиром (Богоявленским) в сан настоятельницы. Следующие посвящения сестёр были в октябре 1910 года и в апреле 1913 года. Постепенно их число достигло почти 100 человек.
Начиная с 1913 года все без исключения сёстры посещали жилища бедных, больницы, богадельни и даже ночлежные дома самого криминального места Москвы – знаменитого Хитрова рынка. Они делали перевязки больным, определяли детей в приюты, находили места безработным.
При Елизавете Фёдоровне в Марфо-Мариинской обители милосердия действовали два храма, в престолы которых были вложены частицы мощей святителя Алексия, митрополита Московского, святой праведной Елисаветы и преподобного Иоанна Лествичника. Первый храм во имя святых жён Марфы и Марии – небесных покровительниц обители – существует со дня её основания. Этот больничный храм был освящён епископом Трифоном 9 (22) сентября 1909 года.
Предметом особого попечения Елизаветы Фёдоровны был второй храм – уникальный Покровский собор, построенный в 1912 году архитектором А. В. Щусевым по новгородско-псковским образцам XVI века. Расписывали храм, освящённый 8 (21) апреля 1912 года митрополитом Московским Владимиром в сослужении епископов Трифона и Анастасия, известные художники – академик М. В. Нестеров и его молодой ученик П. Д. Корин. До сих пор Покровский собор, ставший духовным центром обители, хранит память о её настоятельнице.
1918 года великая княгиня Елизавета Фёдоровна, отказавшаяся покинуть Россию в дни революции, была арестована, а 18 июля того же года, на следующий день после убийства царской семьи в Екатеринбурге, приняла мученическую кончину недалеко от Алапаевска. Её, как и других алапаевских узников, живой сбросили в шахту заброшенного рудника. На краю гибели матушка Елизавета молилась за своих убийц молитвой Христа: «Отче! Прости им, ибо не знают, что делают» (Лк. 23:34).
В начале 1926 года многие сёстры были высланы в Среднюю Азию, в помещениях обители разместили различные учреждения, а в 1928 году Покровский собор был закрыт большевиками. С 1929 года в нём размещался клуб Санпросвета. Фрески Нестерова закрасили краской, а в алтаре, на месте престола, водрузили огромную статую Сталина. Западную стену трапезной использовали как экран для показа кинолент. В 1944—1945 годах храм заняли Государственные центральные художественные мастерские при Комитете по делам искусства, занимающиеся реставрацией древнерусской живописи. Это и спасло один из красивейших храмов Москвы от полного разрушения.
Прославленная в 1981 году Русской Православной Церковью Заграницей (РПЦЗ) в лике святых, великая княгиня Елизавета Фёдоровна была причислена Русской Православной Церковью к лику святых новомучеников Российских в 1992 году. Тогда же архитектурный комплекс на Большой Ордынке постановлением Правительства Москвы был передан Московской патриархии. В 1995 году сестричество было официально преобразовано в Марфо-Мариинскую обитель, которая в 2000 году получила статус Подворья Святейшего Патриарха Московского и всея Руси.
В наши дни, как и при Елизавете Фёдоровне, сёстры обители помогают тяжёлым больным преодолеть недуги и скорби, несут патронажную службу в ожоговом центре Института имени Н. В. Склифосовского и в Главном военном клиническом госпитале имени Н. Н. Бурденко.
Если днём рождения Марфо-Мариинской обители считается 23 февраля 1909 года, то днем её возрождения отныне можно считать 15 сентября 2008 года, когда обитель была торжественно открыта после реконструкции архитектурного комплекса. В тот день Президент России Д. А. Медведев сказал: «Эта святыня всегда пользовалась особым почитанием. В самые непростые для нашей страны годы она давала приют обездоленным, помогала людям обрести веру и новые жизненные силы. В наши дни возобновление деятельности Марфо-Мариинской обители стало ещё одним важным знаком возрождения многовековых духовных традиций России. А её совместное воссоздание – свидетельством конструктивного диалога государства, Русской Православной Церкви и всего общества... Пусть обновлённая Марфо-Мариинская обитель несёт свою высокую миссию, служит укреплению нравственности и семейных ценностей, воспитанию молодого поколения».
Шестого-седьмого сентября 2009 года в центре Москвы при участии членов Попечительского совета программы «Возрождение Марфо-Мариинской обители милосердия. К 100-летию со дня основания», мэрии Москвы, Фонда Святого Всехвального апостола Андрея Первозванного, представителей общественности и СМИ, жителей и гостей столицы прошли торжества, посвящённые вековому юбилею обители.
Возглавил торжества Святейший Патриарх Московский и всея Руси Кирилл, по словам которого, жизнь подвижницы милосердия имеет для нас, современных христиан России, огромное значение, «поскольку являет собой пример воплощения христианского идеала в обществе, которое по своим проблемам очень схоже с нашим временем».
Впервые посетив Марфо-Мариинскую обитель 7 мая 2009 года в новом для себя качестве Почётного председателя Попечительского совета программы, Его Святейшество осмотрел отреставрированный архитектурный комплекс обители, включающий в себя храм Покрова Пресвятой Богородицы, «Голгофу», покои великой княгини Елизаветы Фёдоровны, где расположен музей обители, храм святых праведных Марфы и Марии при лазарете, сестринский корпус, приют, ограду, сторожку, часовню, домик садовника. Святейший Патриарх отметил не только большой объём проведённых работ, но и высокий уровень реставрации. Его Святейшество призвал к распространению опыта деятельности обители как в России, так и за рубежом.
Кульминацией торжества стала передача Марфо-Мариинской обители части мощей святой преподобномученицы великой княгини Елизаветы Фёдоровны, которые покоятся в Иерусалиме в храме святой равноапостольной Марии Магдалины.
